2 研究背景  

乳腺癌是quan球女性癌癥死亡的首要病因，手術聯合化療/放療是標準治療方案，但治療后耐藥頻發且機制未明。細胞毒療法在殺傷腫瘤細胞的同時，會釋放大量損傷相關分子模式（DAMPs），這些危險信號雖可激活抗腫瘤免疫，卻也常誘導免疫抑制微環境，最終削弱療效。近年來，中性粒細胞胞外誘捕網（NET）及其DNA成分（NET-DNA）被證實參與腫瘤進展，但其在化療/放療抵抗中的功能角色、臨床意義及上下游調控機制仍不清楚。

現有靶向NET-DNA的策略（如DNase I降解）雖可抑制轉移，但存在非特異性切割DNA、損害宿主免疫防御等局限。因此，亟需明確治療誘導NET-DNA促進耐藥的精確機制，并識別可干預的關鍵節點。本研究假設NET-DNA通過特異性受體激活癌細胞上皮-間質轉化（EMT）程序從而降低治療敏感性，旨在闡明NET形成的上游驅動信號及癌細胞感知NET-DNA的下游效應通路，為開發精準、低毒的聯合干預策略提供理論依據。

2 研究結果  

1. 化療和放療促進乳腺癌中NET的生成  

研究者首先對4T1移植瘤進行scRNA-Seq，發現多柔比星（DOX）處理后瘤內中性粒細胞比例顯著升高，其轉錄特征顯示NET形成通路（NETosis）富集zui明顯。免疫熒光進一步驗證化療組瘤內Ly6G+中性粒細胞浸潤增加，且H3cit與MPO共定位的NET結構增多，血清MPO-DNA復合物水平同步上升。該現象具有普適性：在激素受體陽性MCF-7模型、HER2富集型MMTV-PyMT自發瘤模型以及接受新輔助化療的81例患者配對活檢標本中，治療后NET表達均顯著上調。放療同樣提升瘤內NET水平，且乳腺癌患者放療后轉錄組數據及Lewis肺癌公共數據均顯示中性粒細胞評分與NET通路增強。綜上，化療/放療通過激活NETosis程序，在原發瘤、轉移灶及外周血中系統性增加NET負荷。

2。NET生成增強削弱化療和放療療效  

通過公共數據集GSEA分析，耐藥腫瘤中NET形成通路顯著上調；對233例接受新輔助化療（NAC）的患者隊列進行Kaplan-Meier分析，高NET組總生存期（OS）和無病生存期（DFS）均顯著縮短，多因素Cox回歸確認其為獨立預后因子。功能上，DNase I降解NET-DNA或利用Pad4?/?小鼠（NET生成缺陷）聯合多柔比星/放療，使4T1和MCF-7模型腫瘤體積較單藥組再縮小40–60%，肺肝轉移灶減少>50%，凋亡指數提升2倍以上。臨床轉化層面，高NET患者對NAC客觀反應率降低，且在HR+亞型中預后價值更突出。這些數據證實NET不僅是耐藥標志物，更是可直接干預的功能性靶點。

3. 巨噬細胞來源的CXCL1/2和CFB在化療/放療下促進中性粒細胞浸潤與NETosis

scRNA-Seq細胞通訊分析顯示巨噬細胞與中性粒細胞互作權重zui強，空間定位顯示NET聚集于巨噬細胞富集區。清除巨噬細胞（抗CSF1R抗體或氯膦酸鹽）后，多柔比星誘導的Ly6G+細胞浸潤和NET生成減少60%以上。機制上，化療后巨噬細胞CXCL1/2與補體因子B（CFB）表達上調3–5倍，CXCR2抑制劑SB225002或CFB抑制劑LNP023聯用使瘤內NET下降55%和48%，腫瘤生長分別再抑制42%與38%。Cxcr2?/?和Cfb?/?基因敲除小鼠進一步驗證該通路必要性，且抑制該軸可減少肺/肝轉移灶形成。因此，巨噬細胞通過分泌CXCL1/2和CFB，構成治療誘導NET擴增的關鍵驅動環路。

4. 巨噬細胞通過吞噬治療誘導的腫瘤碎片促進CXCL1/2和CFB表達及NETosis  

scRNA-Seq顯示化療后巨噬細胞“吞噬體"和“FcγR介導的吞噬"通路富集，體內成像證實Luci?/GFP?/PyMT?腫瘤碎片被F4/80?巨噬細胞吞噬比例增加2–3倍。體外實驗表明，腫瘤碎片刺激使骨髓來源巨噬細胞（BMDM）分泌CXCL1/2和CFB提升4–6倍，而細胞松弛素B（CytoB）抑制肌動蛋白聚合或MerTK抑制劑UNC2250阻斷吞噬后，該效應被逆轉70%以上。體內聯合UNC2250與化療，使瘤內吞噬碎片巨噬細胞減少50%，NET密度同步下降，腫瘤生長延緩。將腫瘤碎片與活細胞共注射可增強NET形成，證實碎片是激活巨噬細胞炎癥程序的危險信號，從而橋接治療損傷與NET擴增。

5. 腫瘤碎片中的CTSC蛋白在化療后促進NETosis  

通過交叉篩選耐藥腫瘤與scRNA-Seq數據，發現CTSC在兩者中均上調；敲低CTSC使碎片誘導的炎癥因子表達降低60%以上。機制上，重組CTSC蛋白直接刺激巨噬細胞，通過TLR4/TRIF（而非MyD88）途徑促進p65核轉位，激活NF-κB。TLR4與RAB5在早期內體共定位，證實內體TLR4識別CTSC。臨床數據支持其相關性：乳腺癌瘤內CTSC表達高于正常組織，且高CTSC患者接受化療后生存期縮短。體內敲低腫瘤細胞CTSC聯合化療，使瘤體積縮小55%，NET密度下降50%，從而確立CTSC為治療損傷感知與NET擴增的關鍵介質。

6. NET通過CCDC25促進乳腺癌治療抵抗

臨床隊列分析顯示，瘤內CCDC25高表達與HR+患者NAC后DFS/OS縮短及病理wan全緩解率降低相關。體外NET刺激使CCDC25?的MCF-7和T47D細胞對多柔比星IC50升高，E-cadherin下降，Vimentin/N-cadherin增加，而敲除或中和CCDC25可逆轉EMT并恢復藥物敏感性。體內實驗證實，CCDC25敲除的MCF-7移植瘤或4T1模型在化療/放療下腫瘤體積分別縮小70%和50%，凋亡指數提升2.5倍，但瘤內NET總量無變化，表明CCDC25作用位于NET下游。MMTV-PyMT模型中，抗CCDC25中和抗體聯合化療顯著抑制腫瘤生長及肺肝轉移，為靶向該受體提供直接證據。

7. NET-CCDC25相互作用通過STAT3激活和EMT促進腫瘤細胞耐藥  

RNA-Seq顯示NET處理后MCF-7細胞EMT通路富集度居首，且STAT3靶基因集同步上調。Pull-down/質譜鑒定PKM2為CCDC25結合蛋白；NET刺激后PKM2核轉位增加，與STAT3 Tyr705磷酸化及TWIST1、SNAIL啟動子結合呈正相關。CCDC25敲除使STAT3核結合能力下降。功能上，敲低STAT3或使用抑制劑Stattic可阻斷NET誘導的EMT標志物轉換，并恢復MCF-7對多柔比星敏感性。PKM2抑制劑Shikonin阻止其核定位，也抑制STAT3磷酸化及EMT。因此，NET-DNA結合CCDC25后招募PKM2入核，進而磷酸化STAT3，驅動EMT轉錄程序，形成完整的“NET-CCDC25-PKM2-STAT3-EMT"耐藥軸。

2 研究結論  

化療和放療通過“腫瘤碎片→巨噬細胞吞噬CTSC→TLR4/TRIF/NF-κB→ CXCL1/2/CFB"信號級聯，顯著增加瘤內及轉移灶的NET形成。釋放的NET-DNA與癌細胞膜受體CCDC25結合，經PKM2介導STAT3磷酸化，激活EMT程序，導致乳腺癌尤其是HR+亞型對治療耐受。靶向阻斷CCDC25、CXCR2或CFB可在保留宿主免疫防御的同時，顯著增強化療/放療療效，為臨床克服耐藥提供了新的組合策略和可干預的生物標志物。

Li H, Zhang Y, Lin J, Zeng J, Liang X, Xu L, Li J, Zhong X, Liu X, Liu Z, Yang X, Zhang Y, Wang S, Song E, Nie M, Yang L. Tumor-derived neutrophil extracellular trap-associated DNA impairs treatment efficacy in breast cancer via CCDC25-dependent epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 2026 Jan 2;136(1):e190557. doi: 10.1172/JCI190557. PMID: 41480760; PMCID: PMC12721893.